All About Restriction Enzymes

Насколько вы знаете о рестрикционных ферментах? Получите лучшее представление о том, что они делают и почему они важны, с этим обзором.

Определение ферментов ограничения

Реституционные эндонуклеазы представляют собой класс ферментов, которые режут молекулы ДНК. Каждый фермент распознает уникальную последовательность нуклеотидов в цепи ДНК. Такие последовательности обычно составляют от 4 до 6 пар оснований. Последовательности являются палиндромными, так как свободная цепь ДНК имеет одинаковую последовательность только в обратном направлении.

Другими словами, обе нити ДНК разрезаются в одном месте.

Где эти ферменты найдены

Рестрикционные ферменты встречаются во многих различных штаммах бактерий, где их биологическая роль заключается в участии в защите клеток. Эти ферменты «ограничивают» чуждую (например, вирусную) ДНК, которая попадает в клетку, разрушая ее. Ячейка-хозяин имеет систему модификации рестрикции, которая метилирует свою собственную ДНК в местах, специфичных для ее соответствующих рестрикционных ферментов, тем самым защищая ее от расщепления. Было обнаружено более 800 известных ферментов, которые распознают более 100 различных нуклеотидных последовательностей.

Использование в биотехнологии

Рестрикционные ферменты используются в биотехнологии для резания ДНК на более мелкие нити для изучения различий длины фрагментов между индивидуумами (Полиморфизм длины фрагмента рестрикции - RFLP). Они также используются для клонирования генов.

Методы RFLP были использованы для определения того, что индивидуумы или группы индивидуумов имеют отличительные отличия в последовательностях генов и шаблонах расщепления рестрикции в определенных областях генома.

Знание этих уникальных областей является основой для отпечатков пальцев ДНК. Каждый из этих способов зависит от использования электрофореза в агарозном геле для отделения фрагментов ДНК. Буфер TBE, который состоит из основания Tris, борной кислоты и ЭДТА, обычно используется для электрофореза в агарозном геле для исследования продуктов ДНК.

Типы ферментов-ограничителей

Существует три разных типа рестрикционных ферментов. Тип I режет ДНК в случайных местах до 1000 или более базовых пар от сайта распознавания. Тип III разрезает примерно 25 пар оснований с сайта. Типы I и III требуют АТФ и могут быть крупными ферментами с несколькими субъединицами. Ферменты типа II, которые преимущественно используются в биотехнологии, вырезают ДНК в пределах распознанной последовательности без необходимости АТФ и являются меньшими и более простыми.

Рестрикционные ферменты типа II названы в соответствии с бактериальными видами, из которых они выделены. Например, фермент EcoRI был выделен из E. палочка . Большая часть общественности знакома с E. coli вспышки в пище.

Рестрикционные ферменты типа II могут генерировать два разных типа разрезов в зависимости от того, разрезают ли они обе нити в центре последовательности распознавания или каждую нить ближе к одному концу распознающей последовательности.

Первый разрез будет генерировать «тупые концы» без выступов нуклеотидов. Последний порождает «липкие» или «сплоченные» концы, потому что каждый результирующий фрагмент ДНК имеет выступ, который дополняет другие фрагменты. Оба они полезны в молекулярной генетике для получения рекомбинантной ДНК и белков.

Эта форма ДНК выделяется из-за ее лигирования (связывания) двух или более различных нитей, которые первоначально не были связаны друг с другом.