Методы очистки белков

Важной частью исследований в области биотехнологии является использование технологий белковой инженерии для разработки или модификации белков с оптимизированными свойствами для конкретных промышленных применений. Для этого ученый должен уметь выделять и очищать интересующие белки, чтобы их конформации, субстратные особенности, реакции с другими лигандами и конкретные виды активности можно было изучить.

Степень чистоты белка зависит от предполагаемого конечного использования белка.

Для некоторых применений сырой экстракт достаточно. Однако для других целей, например, в пищевых продуктах и ​​фармацевтических препаратах, требуется высокий уровень чистоты. Для достижения этого несколько способов очистки белка обычно используют в серии стадий очистки.

Каждый этап очистки белка обычно приводит к некоторой степени потери продукта. Поэтому идеальной стратегией очистки белка является та, в которой достигается наивысший уровень очистки на наименьших ступенях. Выбор тех шагов, которые необходимо использовать, зависит от размера, заряда, растворимости и других свойств целевого белка. Следующие методы наиболее подходят для очистки одного цитозольного белка. Очистка цитозольных белковых комплексов сложнее и обычно требует применения различных методов.

Первые шаги по очистке белка

Первым шагом в очистке белков внутриклеточного (внутри клетки) является получение неочищенного экстракта .

Экстракт будет содержать сложную смесь всех белков из клеточной цитоплазмы и некоторые дополнительные макромолекулы, кофакторы и питательные вещества. Экстракт сырой нефти может использоваться для некоторых применений в биотехнологии, однако, если проблема чистоты является проблемой, следует следовать последующим этапам очистки. Сырые белковые экстракты получают путем удаления клеточного мусора, образующегося при лизисах клеток, который достигается с помощью химических веществ и ферментов, ультразвука или французской прессы.

Осколок удаляют центрифугированием и супернатант восстанавливают. Сырые препараты внеклеточных белков могут быть получены путем простого удаления клеток путем центрифугирования.

Для некоторых приложений в области биотехнологий существует потребность в термостабильных ферментах : ферменты, которые могут переносить высокие температуры без денатурации и при сохранении высокой удельной активности. Организмы, которые их производят, иногда называют экстремофилами. Легкий подход к очистке термостойкого белка состоит в том, чтобы денатурировать другие белки в смеси путем нагревания, затем охлаждать раствор (таким образом, позволяя термостабильному ферменту реформироваться или повторно растворяться, если необходимо. Денатурированные белки затем могут быть удалены центрифугированием.

Этапы промежуточной очистки

В прошлом общий второй этап очистки белка из неочищенного экстракта был осаждением в растворе с высокой осмотической прочностью (т.е.е. солевые растворы). Нуклеиновые кислоты в неочищенном экстракте можно удалить осаждающими агрегатами, образованными стрептомицинсульфатом или протаминсульфатом. Выпадение белка обычно проводят с использованием сульфата аммония в виде соли.

Различные белки будут осаждаться в разных концентрациях сульфата аммония .

В целом, белки с более высокой молекулярной массой осаждаются в более низких концентрациях сульфата аммония. Осаждение соли обычно не приводит к высокоочищенному белку, но может помочь в устранении некоторых нежелательных белков в смеси и концентрировании образца. Соли в растворе затем удаляют диализом через пористую целлюлозную трубку, фильтрацию или гель-эксклюзионную хроматографию.

Современные протоколы биотехнологий часто используют многие коммерчески доступные наборы, которые предоставляют готовые решения для стандартных процедур. Очистка протеина часто проводится с использованием фильтров и подготовленных гель-фильтрующих колонн. Все, что вам нужно сделать, - следовать инструкциям и добавить правильный объем правильного решения и подождать определенный период времени, собирая элюент (что выходит на другом конце колонки) в свежей пробирке.

• Хроматографические методы могут применяться с использованием настольных колонн или автоматизированного оборудования для ВЭЖХ. Разделение с помощью ВЭЖХ может быть осуществлено методами обратной фазы, ионообмена или исключения размеров, а также для образцов, обнаруженных диодной матрицей или лазерной технологией.

  Визуализация и оценка очистки белка

  • Хроматография с обратной фазой (RPC) разделяет белки на основе их относительной гидрофобности . Этот метод является высокоселективным, но требует использования органических растворителей. Некоторые белки постоянно денатурируются растворителями и теряют функциональность во время RPC. Поэтому этот метод не рекомендуется для всех приложений, особенно если необходимо, чтобы целевой белок сохранял активность.
  • Ион-обменная хроматография относится к разделению белков на основе заряда . Колонны могут быть подготовлены для обмена анионом или катионита. Анионные обменные колонны содержат неподвижную фазу с положительным зарядом, которая притягивает отрицательно заряженные белки. Катионообменные столбцы представляют собой обратные отрицательно заряженные гранулы, которые привлекают положительно заряженные белки. Элюцию целевого белка (ов) проводят путем изменения рН в колонке, что приводит к изменению или нейтрализации заряженных функциональных групп каждого белка.
  • Эксклюзионная хроматография ( гель-фильтрация ) отделяет большие белки от малых, поскольку более крупные молекулы быстрее перемещаются через сшитый полимер в хроматографической колонке. Большие белки не вписываются в поры полимера, тогда как более мелкие белки делают и занимают больше времени, чтобы пройти через хроматографическую колонку через их менее прямой путь. Элюат собирают в серии трубок, разделяющих белки на основе времени элюции. Гель-фильтрация является полезным инструментом для концентрирования белкового образца, поскольку целевой белок собирается в меньшем объеме элюирования, чем первоначально добавлялся в колонку.Подобные методы фильтрации могут использоваться во время крупномасштабного производства белка из-за их экономической эффективности.
  • Аффинная хроматография - очень полезный метод «полировки» или завершения процесса очистки белка. Бусины в хроматографической колонке сшиты с лигандами, которые специфически связываются с белком-мишенью. Затем белок удаляют из колонки промыванием раствором, содержащим свободные лиганды. Этот метод дает самые чистые результаты и максимальную удельную активность по сравнению с другими методами.
• SDS-PAGE представляет собой электрофорез в полиакриламидном геле, проводимый в присутствии SDS (додецилсульфата натрия), который связывается с белками, давая им большой чистый отрицательный заряд. Так как заряды всех белков достаточно равны, этот метод полностью их разделяет на основе размера. SDS-PAGE часто используется для проверки чистоты белка после каждого этапа в серии. Поскольку нежелательные белки постепенно удаляются из смеси, количество полос, визуализированных на геле SDS-PAGE, уменьшается, пока не будет только одна полоса, представляющая желаемый белок.
• Иммуноблоттинг представляет собой метод визуализации белка, применяемый в сочетании с аффинной хроматографией. Антитела для конкретного белка используют в качестве лигандов на колонке с аффинной хроматографией. Целевой белок удерживают на колонке, затем удаляют промывкой колонки раствором соли или другими агентами. Антитела, связанные с радиоактивными или красителями, помогают в обнаружении белка-мишени после его отделения от остальной части смеси.

Источники:

Зубай Г. 1988. Биохимия, 2-е издание. Macmillan Publishing Co., Нью-Йорк, Нью-Йорк, США.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Справочник по очистке белков, издание AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Нью-Джерси, США. // www. биохим. uiowa. Edu / Донелсон / Database% 20items / protein_purification_handbook. PDF.