DNA Amplification Through Polymerase Chain Reaction

ПЦР обозначает полимеразную цепную реакцию, способ молекулярной биологии для амплификации сегментов ДНК, путем создания множественных копий с использованием ДНК-полимеразных ферментов в контролируемых условиях. Достаточно просто клонировать одну копию ДНК-сегмента или гена в миллионы копий, что позволяет обнаруживать с помощью красителей и других методов визуализации.

Разработанный в 1983 году процесс ПЦР позволил выполнить секвенирование ДНК и определить порядок нуклеотидов в отдельных генах.

Метод использует термический цикл или повторное нагревание и охлаждение реакции для плавления и репликации ДНК. По мере продолжения ПЦР «новая» ДНК используется в качестве матрицы для репликации и происходит цепная реакция, экспоненциально усиливающая шаблон ДНК.

Методы ПЦР применяются во многих областях биотехнологии, включая белковую инженерию, клонирование, судебную экспертизу (отпечаток ДНК), тестирование на отцовство, диагностику наследственных и / или инфекционных заболеваний и анализ проб окружающей среды.

В судебной экспертизе, в частности, ПЦР особенно полезна, поскольку она усиливает даже наименьшее количество доказательств ДНК. ПЦР можно также использовать для анализа ДНК, которая составляет тысячи лет, и эти методы были использованы для идентификации всего от 800 000-летнего мамонта до мумий со всего мира.

Процедура PCR выглядит следующим образом:

• Инициализация: Эта стадия необходима только для ДНК-полимераз, для которых требуется ПЦР с горячим началом. Реакционную смесь нагревают до температуры от 94 до 96 ° С и выдерживают в течение 1-9 минут.

• Денатурация: Если процедура не требует инициализации, денатурация - это первый шаг. Реакционную смесь нагревают до 94-98 ° С в течение 20-30 секунд. Водородные связи шаблона ДНК разрушаются, и молекулы ДНК с одной цепью создаются.
• Отжиг: Температура реакции ниже от 50 до 65 ° С и выдерживается 20-40 секунд. Праймеры отжигают до одноцепочечной ДНК-матрицы. На этом этапе температура чрезвычайно важна. Если он слишком горячий, праймер может не связываться. Если это слишком холодно, грунт может связываться несовершенно. Хорошая связь образуется, когда последовательность праймеров близко соответствует последовательности шаблонов.
• Удлинение / удлинение: Температура на этом этапе изменяется в зависимости от типа полимеразы. ДНК-полимераза синтезирует совершенно новую ДНК-цепь.
• Конечное удлинение: Эта стадия выполняется при 70-74 ° С в течение 5-15 минут после окончательного цикла ПЦР.
• Заключительное удержание: Этот шаг является необязательным. Температуру поддерживают на уровне 4-15 ° С и подвергают реакции реакции.

Процедура разделена на три этапа:

• Экспоненциальное усиление: В течение каждого цикла продукт (конкретный фрагмент ДНК, который реплицируется) удваивается.
• Выравнивающая стадия: Поскольку ДНК-полимераза теряет активность и потребляет реагенты, реакция замедляется.
• Плато: Больше не накапливается продукт.