Методы для секвенирования ДНК

Область биотехнологии - одно из постоянных изменений. Быстрый рост и развитие передовых исследований зависят от инноваций и творчества ученых и их способности видеть потенциал в базовой молекулярной технике и применять ее к новым процессам. Появление ПЦР открыло много дверей в генетических исследованиях, включая средства анализа ДНК и идентификации различных генов на основе их последовательностей ДНК.

Секвенирование ДНК также зависит от нашей способности использовать гель-электрофорез для отделения нитей ДНК, которые различаются по размеру всего на одну базовую пару.

Последовательность ДНК

В конце 1970-х годов были изобретены две технологии секвенирования ДНК для более длинных молекул ДНК. Это метод Sanger (или дидеокси) и метод Maxam-Gilbert (химическое расщепление). Метод Максема-Гильберта основан на нуклеотид-специфическом расщеплении химическими веществами и лучше всего используется для последовательности олигонуклеотидов (коротких нуклеотидных полимеров, обычно меньших 50 пар оснований). Метод Sanger более часто используется, потому что он оказался технически более простым в применении, и с появлением ПЦР и автоматизации техники легко применяется к длинным нитям ДНК, включая некоторые целые гены. Этот метод основан на прекращении цепи дидезоксинуклеотидами во время реакций удлинения ПЦР.

Метод Сэнгера

В методе Сангера ДНК-цепь, которая должна быть проанализирована, используется в качестве матрицы, и ДНК-полимераза используется в реакции ПЦР для получения свободных нитей с использованием праймеров.

Готовили четыре различные реакционные смеси ПЦР, каждая из которых содержала определенный процент аналогов дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddNTP) с одним из четырех нуклеотидов (АТФ, CTP, GTP или ТТП). Синтез новой цепи ДНК продолжается до тех пор, пока не будет включен один из этих аналогов, и в это время прядь преждевременно усекается.

Каждая реакция ПЦР будет содержать смесь разной длины нитей ДНК, причем все они заканчиваются нуклеотидом, который был дидезоксимеченным для этой реакции. Затем гель-электрофорез используется для отделения нитей четырех реакций в четырех отдельных дорожках и определения последовательности исходного шаблона на основе того, какие длины концов концов заканчиваются нуклеотидом.

В автоматической реакции Sanger используются праймеры, которые помечены четырьмя различными цветными флуоресцентными метками. Реакции ПЦР в присутствии различных дидезоксинуклеотидов выполняются, как описано выше. Однако затем четыре реакционные смеси затем объединяют и наносят на одну полосу геля. Цвет каждого фрагмента детектируется с использованием лазерного луча, и информация собирается компьютером, который генерирует хроматограммы, показывающие пики для каждого цвета, из которых может быть определена последовательность ДНК-шаблона.

Как правило, метод автоматического секвенирования является точным только для последовательностей длиной до 700-800 базовых пар. Тем не менее, можно получить полные последовательности больших генов и, фактически, целые геномы, используя пошаговые методы, такие как последовательность праймера и дробовика.

В Walking , обрабатываемая часть большего гена секвенируется с использованием метода Сенгера. Новые праймеры генерируются из надежного сегмента последовательности и используются для продолжения секвенирования части гена, выходящего за пределы исходных реакций.

Секвенирование дробовика влечет за собой случайное разделение интересующего сегмента ДНК на более подходящие (управляемые) размерные фрагменты, секвенирование каждого фрагмента и организацию фрагментов на основе перекрывающихся последовательностей. Этот метод стал проще благодаря применению компьютерного программного обеспечения для организации перекрывающихся кусков.