Как работает полимеразная цепная реакция для амплификации генов

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является молекулярно-генетическим методом для создания нескольких копий гена и также является частью процесса секвенирования генов.

Как работает реакция полимеразной цепи?

Генные копии производятся с использованием образца ДНК, и эта технология достаточно хороша, чтобы сделать несколько копий из одной копии гена, найденного в образце. ПЦР-амплификация гена, чтобы сделать миллионы копий, позволяет обнаруживать и идентифицировать последовательности генов с использованием визуальных методов, основанных на размере и заряде (+ или -) фрагмента ДНК.

В контролируемых условиях небольшие сегменты ДНК генерируются ферментами, известными как ДНК-полимеразы, которые добавляют дополнительные дезоксинуклеотиды (dNTP) к части ДНК, известной как «шаблон». В качестве отправной точки для полимеразы используют еще более мелкие фрагменты ДНК, называемые «праймеры». Грунтовки представляют собой небольшие искусственные фрагменты ДНК (олигомеры), обычно длиной от 15 до 30 нуклеотидов. Они создаются путем знания или угадывания коротких последовательностей ДНК на самых концах амплифицируемого гена. Во время ПЦР секвенированную ДНК нагревают и разделяют двойные нити. После охлаждения праймеры связываются с шаблоном (называемым отжигом) и создают место для начала создания полимеразы.

Методика ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) стала возможной благодаря открытию термофилов и ферментов термофильной полимеразы (ферменты, которые сохраняют структурную целостность и функциональность после нагревания при высоких температурах).

Шаги, используемые в методе ПЦР, следующие:

Создается смесь с оптимизированными концентрациями ДНК-матрицы, полимеразным ферментом, праймерами и dNTP. Способность нагревать смесь без денатурации фермента позволяет денатурировать двойную спираль образца ДНК при температурах в пределах 94 градусов Цельсия.

После денатурации образец охлаждается до более умеренного диапазона, около 54 градусов, что облегчает отжиг (связывание) праймеров с одноцепочечными матрицами ДНК.

• На третьем этапе цикла образец повторно нагревается до 72 градусов, идеальная температура для ДНК-полимеразы Taq для удлинения. Во время удлинения ДНК-полимераза использует исходную одиночную цепь ДНК в качестве матрицы для добавления дополнительных dNTP к 3'-концам каждого праймера и генерирует участок двухцепочечной ДНК в области интересующего гена.
• Грунты, которые отожжены к последовательностям ДНК, которые не соответствуют друг другу, не остаются отожженными при 72 градусах, что ограничивает удлинение гена, представляющего интерес.
• Этот процесс денатурации, отжига и удлинения повторяется несколько (30-40) раз, тем самым увеличивая экспоненциально количество копий желаемого гена в смеси.Хотя этот процесс был бы довольно утомительным, если его выполнить вручную, образцы могут быть приготовлены и инкубированы в программируемом термоциклере, теперь обычном в большинстве молекулярных лабораторий, и полная реакция ПЦР может быть выполнена через 3-4 часа.

Каждый денатурирующий этап останавливает процесс удлинения предыдущего цикла, таким образом, усекая новую нить ДНК и сохраняя ее примерно до размера желаемого гена.

Продолжительность цикла удлинения может быть увеличена или короче в зависимости от размера интересующего гена, но в конечном итоге с помощью повторяющихся циклов ПЦР большинство шаблонов будут ограничены размером только интересующего гена , так как они будут получены из продуктов обоих праймеров.

Существует несколько различных факторов для успешной ПЦР, которые можно манипулировать для улучшения результатов. Наиболее широко используемым методом тестирования на присутствие продукта ПЦР является электрофорез в агарозном геле. Используется для разделения фрагментов ДНК на основе размера и заряда. Затем фрагменты визуализируются с использованием красителей или радиоизотопов.

Эволюция

С момента открытия ПЦР были обнаружены ДНК-полимеразы, отличные от оригинальной Taq. Некоторые из них обладают лучшей «корректурной» способностью или более стабильны при более высоких температурах, тем самым улучшая специфичность ПЦР и уменьшая ошибки при введении неправильного dNTP.

Некоторые вариации ПЦР были разработаны для конкретных применений и в настоящее время используются в молекулярно-генетических лабораториях. Некоторые из них представляют собой ПЦР в реальном времени и ПЦР обратной транскриптазы. Открытие ПЦР также привело к разработке секвенирования ДНК, отпечатков пальцев ДНК и других молекулярных методов.